甲基化测序如何确认RNA的质量？

xingshanzhan · 发表于 2021-6-28 08:54:47

　　实时荧光定量PCR技术是通过测定RNA的转录水平来评估基因的活力。RNA样本提取的zhi量直接影响基因表达分析。甲基化测序影响RNA品质的因素有以下三种：RNA浓度、RNA纯度和RNA完整性。
　　检测RNA浓度、纯度和完整性的方式主要有以下几种：
　　紫外分光光度计法：
　　测量260nm吸收值计算RNA浓度，测量260nm/280nm吸收值的比值，用于评估RNA纯度。需要注意的是：甲基化测序在检测核酸物质时应该在固定的PH溶液中进行。
　　260nm/280nm的比值范围在1.9~2.1之间。＜1.9，说明有蛋白质残留；＞2.1，说明RNA可能发生降解。
　　琼脂糖凝胶电泳：
　　完整的RNA通常有三条带，最亮的是28S条带，其次是18S条带，最淡的是5S条带（部分试剂盒提取时会过滤掉5S条带）。通过琼脂糖凝胶电泳可以检测28S和18S的比值。该方法主要用于检测RNA的纯度和完整性。
　　如果28S和18S条带明亮、清晰、条带锐利，28S的亮度在18S条带的两倍以上，我们认为RNA的zhi量最好。
　　若RNA条带出现弥散，原因可能：RNA被核酸酶降解、电压或电流过大、上样量过高或过低等。
　　上述两种方法在实验室比较常用，此外还有几种检测方式供大家选择。
　　荧光染料检测：
　　通过荧光染料和RNA结合，荧光活性增强。此方法的灵敏度较高，主要用于检测RNA的浓度。
　　微毛细管电泳：
　　可使用软件的RIN（RNAIntegrityNumber）分数评估，10为RNA完整性最好，0为最差。此方法的灵敏度和分辨率较高，可用于检测RNA浓度、纯度和完整性。
　　3’-5’完整性检测：
　　是在一个RNA样本中检测GAPDHmRNA的完整性来代表所有RNA的完整性，主要用于检测RNA的完整性。
　　得到高品质RNA的小建议：
　　1、尽量避免RNA酶污染，使用无RNA酶的耗材和试剂，建议将扩增前后的场所分开。
　　2、尽量减少采样时间，样品处理后快速冷冻，可以加入RNA保护剂。
　　3、RNA提取过程中可以使用RNA酶抑制剂。
　　4、存储过程中避免反复冻融。

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